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利用间接放射免疫法检测样品的mTNF

利用间接放射免疫法检测样品的mTNF

实验原理

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)是一类能直接导致某些肿瘤细胞坏死的细胞因子,有TNF-α与TNF-β两种类型。TNF-α主要来源于活化的单核/巨噬细胞,TNF-β主要来源于活化的T淋巴细胞。虽然两型TNF的细胞来源不同,结构也不同,但均能与不同的受体结合,故具有极其相似的生物学活性。TNF可进入体液成为分泌型(或可溶性)TNF(sTNF),也可与细胞膜结合成为跨膜型(或膜结合型)TNF(mTNF)。应用标记的抗TNF特异性抗体,利用抗原抗体反应检测TNF即为TNF的免疫学检测法。可检测待测样品中sTNF的精确定量,也可检测mTNF,还可区分TNF-α与TNF-β两种类型。主要方法有ELISA法、RIA法、FIA、FCM或FACS法等。

实验试剂

1. 1%多聚甲醛

2. 含3%牛血清白蛋白的PBS(3%BSA-PBS)及PBS

3. 一抗:兔抗TNF的抗血清

4. 二抗:125I标记的驴抗兔IgG

5. 未免疫兔血清

6. 制备好的巨噬细胞悬液(细胞浓度为1×106ml)

实验设备

1. 96孔PVC板(聚本乙稀板)

2. γ-计数仪,温浴箱,刻度吸管,毛细吸管,加样器(头)

实验步骤

1. 将准备好的巨噬细胞悬液加入PVC板各孔中,0.1ml/孔,再用1%多聚甲醛固定于PVC板中,然后用PBS洗去多余的多聚甲醛;

2. 设立不同倍比稀释度的TNF标准品;

3. 加入3%BSA-PBS,每孔0.1ml, 37℃孵育1h,以封闭抗体非特异性结合位点;

4. 弃上清,每孔加入1:50稀释度的兔抗TNF血清(一抗)。以未免疫兔血清作为阴性对照,37℃孵育45min;

5. 用PBS洗3次,以去除未结合的一抗;

6. 加入125I标记的驴抗兔IgG(二抗,2000cpm/孔),37℃孵育45min;

7. 用PBS充分洗板后,用γ-计数仪测量放射活性;

8. 从标准曲线中即可求得待测细胞mTNF含量。

沪公网安备 31011702004360号