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ELISA中碰到的问题

ELISA中碰到的问题

今天做了ELISA,是测抗体的,做出来之后,阴性孔的后几个孔和空白对照组也显色了,而且测出来的OD值没有规律,有几个相同稀释倍数的孔和副孔OD值相差也大,分析了一下,觉得可能有几个问题。

1)要么是脱脂奶粉的封闭时间不够,我封闭了一个小时

2)用PBST洗板的时候,甩的方向不对,造成了孔之间的污染

3)二抗没洗涤干净,我用PBST洗涤了五次,每次间隔三分钟,要是再洗不干净我也不知道怎么做了

1."阴性孔的后几个孔和空白对照组也显色了"现象

原因:检测抗体的工作浓度是否过高?检测抗体与包被物是否发生交叉反应?

2.“相同稀释倍数的孔和副孔OD值相差也大”现象

原因:孔间的CV值是多少?操作人员的操作熟练程度?移液设备的精确度如何?

封闭一般有很多种封闭液:2%-5%脱脂奶粉;10%-15%小牛血清;0.25%-1%明胶;1%BSA;1%-2%OVA;10-15%羊血清……。封闭的作用是将孔内为包被上抗原的位点封闭住,以防一抗/二抗发生非特异性吸附,从而干扰ELISA检测结果。封闭可以采取37度2小时,也可以4度过夜。封闭时可以采取满孔封闭,效果会更好。

此外,洗涤的时候需注意,洗涤液勿加的太多,以防止孔孔之间串孔;一抗二抗洗板时蕞好多洗几遍,5遍左右吧,间隔三分钟就差不多了。


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